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              獸醫體外診斷的趨勢--分子診斷

              摘要: 寵物已成為現代人的重要家庭成員,圍繞其吃穿用度、生老病死,形成了一條千億級的“經濟”產業鏈。其中,需求剛性大、消費支出高的寵物醫療更占據了產業鏈中的核心地位,成了寵物消費中的“大頭”。寵物醫療服務包括 ...

               

               

                     寵物已成為現代人的重要家庭成員,圍繞其吃穿用度、生老病死,形成了一條千億級的“經濟”產業鏈。其中,需求剛性大、消費支出高的寵物醫療更占據了產業鏈中的核心地位,成了寵物消費中的“大頭”。

              寵物醫療服務包括為寵物提供疾病診療和日常保健服務,是寵物行業中僅次于寵物食品的第二大細分行業。按疾病種類劃分,寵物醫療服務包括寵物外科疾病、內科疾病、皮膚病、傳染病診療及寵物免疫等。傳染病是由某些具有致病性的微生物,如細菌、病毒等引起的,能夠在某種動物或多種動物之間傳播的一些疾病。養好寵物的關鍵是疾病的防治,尤其是一些傳染病,其發病急、傳播快,對動物的健康威脅極大。

               

              在隨著人們生活質量的逐漸提升,犬貓在人們生活中扮演角色也日漸重要。并且,隨著飼主的觀念和寵物醫療質量的逐年提升,在動物疾病的診斷的準確度上,也從以前的「盲人摸象」逐漸走向分子診斷的水平。

               

              目前,分子診斷技術以其具有的靈敏度高、特異性強、簡便快速、可進行定性、定量檢測等優勢,已廣泛應用于感染性疾?。ò毦愿腥?、病毒性感染、寄生蟲、真菌、人畜共患疾病等)、腫瘤等多個領域。分子診斷的檢測結果對臨床醫療決策的貢獻度進一步提升,檢驗結果的重要性也達到空前的高度。

              在寵物傳染病檢測技術方面,分子診斷核酸檢測方法同樣具有極高的靈敏度和特異性,可最大程度縮短傳染病檢測的窗口期。該方法也是人類傳染病臨床確診的黃金方法。

              其中以PCR為代表技術的是當前分子診斷最常用的方法。PCR技術是用一對寡聚DNA作為引物,通過變性-退火-延伸這一周期多次循環,使目的DNA得到擴增,具有高靈敏性和高特異性的優勢。

               

               

              而實時熒光定量PCR實現了PCR從定性到定量的質的飛躍,實時熒光定量PCR技術(將熒光基團加入到PCR反應體系中,借助熒光信號,累積實時監測整個PCR的進程)不僅具有傳統PCR的優勢,還具有特異性強、靈敏度高、重復性好、反應速度快、定量準確和自動化程度高等特點,成為國際公認的核酸分子定量的標準方法。

              實時熒光定量PCR可以早期、精準的診斷寵物疾病

              在目前的寵物臨床工作中,廣泛存在著對一部分病原診斷困難或者不能精確診斷的問題。具體表現在以下幾個方面:

              1、現有的診斷技術靈敏度低

              如:常見用于病毒診斷的膠體金試紙。雖然膠體金試紙可以提供快速診斷,但是該種方法是從蛋白水平對病原進行檢測,存在一定的交叉反應和動物自身抗體干擾,導至臨床應用的過程中出現假陽性和假陰性的結果;

              2、疾病的早期診斷(如潛伏期)和抗原要求較高的疾病

              如:使用傳統的診斷技術(膠體金試紙和ELISA檢測方法)無法提供準確的診斷依據。如臨床上常見犬瘟熱和細小病毒;

              3、臨床上有很多的病原沒有商品化的便捷的試劑商業化生產

              這一部分的病原診斷(如貓傳染性腹膜炎)目前在獸醫臨床工作中還不能做到在醫院內診斷。如果需要做血涂片、糞檢的疾病,導至主觀性較強,易產生漏檢的現象;

              4、在疫病防治過程中

              如注射疫苗是預防犬貓病毒性疾病的主要措施,但是血清學檢測出的抗體很難區別是疫苗免疫還是病毒感染產生的,而PCR能夠精準的檢測病原體;

              5、臨床上還有一些病原在微量時存在診斷困難的情況

              如小巴貝斯蟲等疾病。

              因此PCR(尤其是實時熒光定量PCR)使這些疾病的精準診斷成為現實。

              農業部《2013年國家動物疫病監測與流行病學調查計劃》的要求,以及我國現行的寵物疾病診斷國家標準中頒布了《犬細小病毒診斷技術(GB/T27533-2011)》和《犬瘟熱診斷技術(GB/T27532-2011)》國家技術標準,明確將犬細小病毒和犬瘟熱病毒核酸檢測(而非試紙卡檢測)作為診斷標準,這也說明核酸檢測在動物疫病診斷中的重要地位。

               

               

              選擇一款合適的PCR產品對于寵物的診斷尤為重要

              在臨床工作中,目前有很多PCR供獸醫師們選擇,有核酸免提取的、有等溫擴增的、有液體試劑和凍干試劑的、有全自動PCR,讓獸醫師們無從選擇,到底應該怎樣客觀的看待這些,做到科學的選擇呢,接下來會詳細的闡述。

              核酸免提取會導至假陰性的概率增加

              核酸提取是分子診斷實驗的“第一步”,是十分重要的環節,因為首先必須把寵物樣品中的核酸提取出來,才能進行后續的檢測,可見核酸提取的重要性。核酸提取具有兩大目的:提純(消除樣本中干擾物質)和濃縮(提高樣本中核酸濃度)。因為,對于PCR所檢測樣品(血清、全血、細胞保存液和糞便等)中有很多干擾物和抑制物,核酸含量低,直接檢測核酸難度高,靈敏度差。因此檢測之前,需要將樣品中的核酸裂解,提純并濃縮,也就是核酸提取。這是業界的主流做法。

              比如臨床上一些鼻咽拭子和口腔拭子的洗脫液,成分很簡單,幾乎是生理鹽水+少量分泌物+大量游離的病毒,可以不進行核酸提取直接擴增。貓的皰疹病毒FHV-1用拭子在口鼻采樣就能檢出。如果拭子的洗脫液比較干凈,可以省去提純這一步,但是不經過濃縮,降低了檢測的靈敏度。

              此外,復雜樣本必須要進行核酸提取。比如貓的冠狀病毒(FCoV)大多檢測的是貓的腹水,腹水樣本非常粘稠,里面蛋白很多,無法直擴檢測。這種樣本免提取直接擴增就不是靈敏度下降的問題了,而是無法檢測出來的問題。

              等溫擴增成本高、較多產品有專利保護的缺點

              等溫擴增儀器簡單,檢測時間快,檢測靈敏度與PCR相仿。但等溫擴增技術多為外國發明,現在還都在專利保護期內,應用尚不普及,相對來說成本也較高。

              真空凍干技術具有諸多優點,是PCR試劑的趨勢

              PCR的試劑成分包括純化水、引物、聚合酶、Mg2+、dNTP和探針等成分。這些成分混合后,常溫下會逐漸降解失效。所以液體PCR試劑需要分裝到不同的小瓶-20℃保存,用時再解凍配制。因此,試劑的儲運和操作都比較麻煩。

              而真空凍干技術可將試劑內部的水分完全升華掉,同時不破壞有效成分。凍干之后的試劑可以常溫保存,無需冷鏈運輸。使用時加入水就能溶解,然后像正常的PCR試劑使用,因此是PCR試劑的趨勢。

              而我們蘇州先達基因,擁有完全獨立自主知識產權的酶促重組等溫擴增技術(ERA技術),通過基因工程對重組酶、外切酶、聚合酶等多酶體系進行改造,建立特殊擴增反應體系,在30-42℃恒溫條件下,20分鐘內,可將微量DNA/RNA的特異性區段在數分鐘內擴增109倍,從而達到可檢出水平。該技術具備PCR擴增的特異性和恒溫擴增LAMP技術的便捷性,準確度極高。

              具有可檢測性、靈敏性、快速性以及特異性等優點,反應組分已經混合好并冷凍干燥成干粉狀態,操作簡便,易于保存。且全程自產,相對價格也更有優勢。同時配合其熒光恒溫擴增儀,可以實現核酸現場檢測,不再局限場地、時間或者人員。

              分子診斷作為體外診斷技術的第四次革命,應用分子生物學方法,檢測患者(寵物)體內遺傳物質結構或表達水平的變化,繼而作出診斷的技術,它為疾病的預防、預測、診斷、治療和轉歸提供了更為準確的信息。較其他檢測方法相比具有不可比擬的優勢。而PCR作為分子診斷最常用的檢測方法,在寵物的臨床診斷中也會越來越重要。同時也相信我們先達基因的恒溫擴增核酸檢測技術,憑借其檢測快速、價格低廉等優勢,在及時現場檢測市場中會脫穎而出。

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